革蘭氏染色的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟
革蘭氏染色的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟:
1。 涂片:左手持菌液試管,右手持接種環(huán),用接種環(huán)從試管培養(yǎng)液中取環(huán)菌,從酒精燈外焰穿過(guò),于載玻片中央涂成薄層(事先在背面做好標(biāo)記圓圈)即可,或先滴小滴無(wú)菌水于載玻片中央,用接種環(huán)從斜面上挑出少許,與載玻片上的水滴混合均勻,涂成薄層。
拔或塞試管塞時(shí),應(yīng)將試管口通過(guò)火焰略加燒灼,后將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌。
2。 干燥:涂片后在室溫下自然干燥,也可在酒精燈上略加溫,使之迅速干燥,但勿靠近火焰。
3。 固定:常用高溫進(jìn)行固定。即手持載玻片端,標(biāo)本面朝上,在燈的火焰外側(cè)快速來(lái)回移動(dòng)3~4次,共約3~4秒。要求玻片溫度不超過(guò)60℃,以玻片背面觸及手背皮膚不覺(jué)過(guò)燙為宜,放置待冷后染色。
4. 染色:
(1)初染: 加草酸銨結(jié)晶紫滴,約分鐘,水洗。
(2)媒染: 滴加碘液沖去殘水,并覆蓋約分鐘,水洗。
(3)脫色: 將載玻片上的水甩凈,并襯以白背景,用95%酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時(shí)為止,約20—30秒,立即用水沖凈酒精。
(4)復(fù)染: 用番紅液染1—2分鐘,水洗。
5. 鏡檢: 干燥后,置油鏡觀察。革蘭氏陰性菌呈紅色,革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色。以分散開(kāi)的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn),過(guò)于密集的細(xì)菌,常常呈假陽(yáng)性。
6. 同法在載玻片上以大腸桿菌與枯草芽孢桿菌混合制片,作革蘭氏染色對(duì)比。
革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴(yán)格掌握酒精脫色程度,如脫色過(guò)度,則陽(yáng)性菌可被誤染為陰性菌;而脫色不夠時(shí),陰性菌可被誤染為陽(yáng)性菌。此外,菌齡也影響染色結(jié)果,如陽(yáng)性菌培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),或已死亡及部分菌自行溶解了,都常呈陰性反應(yīng)