革蘭氏染色的基本原理和影響其結果準確性的關鍵因素分析
革蘭氏陽性菌染色是項經典的病菌鑒別手段，自十九世紀八十年代荷蘭的醫(yī)生GRAM開創(chuàng)起，迄今早已近個半個世紀，依然在病菌的檢驗和評定歸類上被廣泛運用著。在中國，GB4789系列產品的標準中許多 病原菌的檢驗也都必須開展革蘭氏陽性菌染色，由此可見其必要性。乃至可以說沒有精確把握革蘭氏陽性菌染色的微生物菌種檢查員，不容易是個達標的檢查員。
革蘭氏陽性菌染色基本原理
病菌先經過堿性染料結晶紫染色，然后經碘液開展媒染，以后用酒精脫色，在定標準底下的病菌媒染后的色調不被脫下，有的可被脫下，因而可把病菌分成兩類，前面種稱為革蘭氏陽性菌(G+),后面種為革蘭氏陽性菌陰性菌(G-)。為便捷進步觀查，脫色后可再用種鮮紅色染劑如偏堿番紅等開展復染。陽性菌仍帶藍紫色，陰性菌則被再次沾染鮮紅色。有芽胞的鏈球菌和大部分的革蘭陰性桿菌，及其全部的放線菌和細菌都呈革蘭氏陽性菌正反映；弧菌、球菌和大部分高致病的無枯草芽孢菌都展現(xiàn)負反映。
細菌細胞根據(jù)結晶紫初染和碘液媒染后，在植物細胞內產生了不溶解水的結晶紫與碘的氧化氮合酶，革蘭氏陽性菌因為其植物細胞偏厚、肽聚糖網層級較多且化學交聯(lián)高密度，故遇酒精或甲苯脫色解決時，因缺水反倒使網眼變小，再再加它沒有脂質，故酒精解決不容易出現(xiàn)間隙，因而可以把結晶紫與碘氧化氮合酶緊緊留到壁內，使其仍呈藍紫色；而革蘭氏陽性菌陰性菌因其植物細胞薄、外膜層脂質成分高、肽聚糖層薄且化學交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以脂質主導的外膜快速融解，薄而疏松的肽聚糖網不可以阻攔結晶紫與碘氧化氮合酶的總混，因而根據(jù)酒精脫色后仍呈沒有顏色，再經過沙黃等鮮紅色染劑復染，就使革蘭氏陽性菌陰性菌呈鮮紅色。
革蘭氏陽性菌染色法般流程
1.抗酸染色固定不動。在整潔的蓋玻片中間滴加滴純凈水，用接種環(huán)開展無菌操作原則，挑取塑造物少量，置蓋玻片的水珠中，與水混和制成菌懸液并施膠成直徑厘米的層析。為防止因菌數(shù)過多集聚結團，不利觀查病菌個人形狀，可在蓋玻片側開展所述實際操作，而在另側再加滴水，從已施膠的菌液中再取環(huán)在此水珠中開展稀釋液，施膠成層析。若原材料為液體塑造物或固態(tài)塑造物中洗掉制取的菌液，則立即施膠于蓋玻片上就可以，如菌液濃度值很大，也可應用水珠再開展次稀釋液。
抗酸染色好是在室內溫度標準下使其當然干躁，有時候以便使之干得更快些，可將標本采集朝向上，手執(zhí)蓋玻片端的兩邊，小心地在酒精燈火苗上邊較高的部位略微加溫，使水份揮發(fā)，但切忌緊貼火苗或加溫時間太長，防止標本采集烤枯而形變。
標本采集干躁后即開展固定不動，固定不動的目地有三個：(1)殺掉微生物菌種，固定不動細胞膜的結構。(2)確保菌體能更堅固的黏附在蓋玻片上，避免標本采集水清洗時被水清洗掉。(3)更改染劑對體細胞的滲透性，由于死的原生質比活的原生質便于染色。
固定不動經常運用高溫，手持蓋玻片的端(涂有標本采集的遠側),標本采集往上，在酒精燈火苗表層盡早的往返根據(jù)3-4次，共約3s-三秒,并時常以蓋玻片反面加溫，蓋玻片反面觸肌膚，以不知不覺中過燙為宜(不超過60℃),待置放冷后，再開展染色。
2.染色。在固定不動過的抗酸染色菌膜上滴加草酸銨結晶紫染色液，染色液應徹底遮蓋全部菌膜，染色1min。
3.水清洗。染色到定的時間，拿住裝片使之成450角，用細微的流水把不必要的染劑清洗掉，被菌體吸咐的染劑則保存。
4.媒染。加碘液遮蓋涂面染1min。在媒染解決時，媒染劑與染劑產生不可溶的化學物質，可提升染劑和病菌的感染力。
5.水清洗。用細微的流水遲緩清洗抗酸染色上的染色液，用吸水海綿吸走。
6.脫色。加95%酒精數(shù)滴，并輕輕地搖晃開展脫色，20s-30s后再開展水清洗，吸去水份。
7.復染。蕃紅染色液染色10s后，飲用水清洗。
8.干躁。染色的結果，革蘭氏陽性菌正反映菌體都呈藍紫色，負反映菌體都呈鮮紅色。
危害染色結果精確性的要條件：
1.實驗試劑危害。它是大家先應當保證 的，大家應用的實驗試劑務必是合理的。試驗室理應創(chuàng)建合理的實驗試劑管理流程，從實驗試劑的工程驗收到儲放、應用、到期后的廢料解決都需有嚴苛要求，保證 大家應用的實驗試劑是合理的。磨刀不誤砍柴工工欲善其事，這也是大家實驗取得成功基本的環(huán)。
2.染色菌的挑選。菌齡對革蘭氏陽性菌染色結果的危害是十分大的。大家染色全過程中挑選的菌應該是處在活躍性成長期，那樣的病菌特異性強，生理學特點顯著，因此 染色的結果精確度高，般狀況下不容易出現(xiàn)偏差。塑造時間較長的革蘭氏陽性菌，因為體細胞脆化，乃至有部分菌在染色以前就早已身亡或是自主融解了，導致植物細胞滲透性提升，便會展現(xiàn)出假陰性。以橙黃色鏈球菌為例子，金葡是典型性的革蘭氏陽性菌，有些人以前統(tǒng)計分析過塑造至不樣時間的金葡的革蘭氏陽性菌染色結果，結果顯示，在金葡活躍期的22h-26h中間，染色結果的準確度基礎能夠做到100%，而超出26h以后，準確度就剛開始降低，塑造至36h時，準確度大約會降低30%上下。因此 我們在染色時，定要挑選處在活躍期、特異性強的菌體，在檢驗全過程中定要嚴苛的在標準規(guī)定的時間范圍內開展染色實驗，不可以提早或是推遲。
3.涂菌的情況。在染色開始的施膠中，在挑取菌體后應當在無菌水上漆成薄薄菌膜。而在施膠全過程中，若是菌體沉積，也會巨大危害染色結果的精確性。菌體沉積過多，通常菌體中間越來越沒什么間隙，而其植物細胞的成份危害導致了脫色的狀況不佳，非常容易造成陽性的結果。另外，在初染、媒染及復染的全過程中，應將染色液遮蓋全部菌膜，防止部分菌染色而另部分菌沒有染色。因而在抗酸染色全過程定要將菌膜涂得少而勻稱，那樣才可以達到好實際效果。
4.媒染時間。媒染時間對革蘭氏陽性菌陰性菌的染色結果有非常大危害。因為媒染時間太長，結晶紫在碘液長期功效下太過堅固融合在菌體植物細胞上，危害了酒精的脫色實際效果，進而會造成 這類陽性的實際效果。以典型性的革蘭氏陽性菌陰性菌腸子埃希氏菌為例子，有些人做了統(tǒng)計分析，媒染時間嚴控在40s-60s以內，染色結果準確度基礎可做到100%，而超出60s準確度會出現(xiàn)定的減少，若媒染超出100s，準確度乃至可減少貼近20%上下。因而在媒染全過程中定要留意媒染時間，操縱在50-60s為宜。
5.酒精脫色。酒精脫色也是個對結果危害很大的操作流程。革蘭氏陽性菌陰性菌和革蘭氏陽性菌關鍵的差別是植物細胞肽聚糖層薄厚和構造，革蘭氏陽性菌陰性菌植物細胞肽聚糖層太薄，脂多糖成分高因而在酒精脫色時，細菌細胞壁的含糖量成份會被酒精融解，擴大了植物細胞的滲透性，結晶紫及碘氧化氮合酶就迅速被酒精過柱，以后便會被沙黃復染呈鮮紅色；而陽性菌肽聚糖層厚，脂多糖少，酒精只有具有脫干實際效果而沒法進到，那樣結晶紫和氧化氮合酶就沒法過柱出去使體細胞呈藍紫色。因而，酒精脫色時間較短，脫色實際效果不佳，會造成 陰性菌菌體內的結晶紫和氧化氮合酶不可以合理的所有過柱出去，便會出現(xiàn)顯著的偏差，使陰性菌出現(xiàn)陽性。而過柱時間太長，也會造成 陽性菌的植物細胞被酒精毀壞，造成 體細胞內的藍紫色被過柱，展現(xiàn)假陰性。因而過柱時間也是革蘭氏陽性菌染色的重要環(huán)節(jié)。過柱時間理應嚴控在20s-30s中間，另外確保過柱實際效果。
小結下，在全部革蘭氏陽性菌染色全過程中，在確保實驗試劑合理的前提條件下，必須嚴控的好多個層面：染色菌務必是在其活躍期內，施膠情況不能太厚，媒染時間嚴控在50s-60s中間，脫色時間嚴控在20s-30s。掌握之上的重要基準點，革蘭氏陽性菌染色基礎就不容易出現(xiàn)難題啦！
