瑞氏染色液介紹
瑞氏染色液是最常用、最簡單的染色方法。在化學作用下,瑞氏試劑中的酸性伊紅與堿性美藍混合,變成中性伊紅美藍,久置后,經(jīng)氧化,含有天青。這三種染料分別與細胞核和漿液中的NH3+和COO-結合,使細胞核和漿液著色。由于是中性染料,緩沖液調(diào)節(jié)酸堿度,細胞感染后藍紅等顏色適中,核染質(zhì)、胞漿及其顆粒顏色清晰。
瑞氏染料是由堿性染料美藍(Methvlemblue)和酸性染料黃色伊紅(EostmY)合稱為瑞氏(美藍-伊紅Y)染料。伊紅鈉鹽的有色部分為陰離子,無色部分為陽離子,其有色部分為酸性,因此被稱為酸性染料。美藍通常是堿性氯鹽,其中間產(chǎn)物結晶為三氯化鎂復鹽,其有色部分為陽離子,無色部分為陰離子,與伊紅鈉鹽相反。
瑞氏染色液染液配制
溶劑
以甲醇為瑞氏染料溶劑,即瑞氏染液。作為瑞氏染料的良好溶劑,甲醇有兩種作用:
甲醇使瑞氏染料中的美藍(M)和伊紅(E)在溶液中分解,使細胞成分有選擇地吸附其中的有色物質(zhì)進行著色。在準備好的瑞氏染液中,如果放置時間過長,美藍可以氧化并含有天青。美藍天青和伊紅化合物可以將核染成紫紅色,但不能將胞漿染成藍色。多余的美藍可以將胞漿染成藍色。染色主要是化學作用,是離子結合的反應。
(2)甲醇脫水能力強,能將細胞固定在一定形態(tài),增加細胞結構表面積,提高細胞對染料的吸收。同時,由于甲醇吸附染色液中的水,染色液會升溫,加速染色反應。
瑞氏染液配制:
瑞氏染料830mg或1g。
500ml或600ml甲醇(AR)。
首先,將瑞氏染料干燥(提前放入溫箱干燥過夜)放入乳缽中,用乳棒輕輕敲擊成粉末狀,然后研磨成細粉狀(聽不到研芝麻聲)。加入少許甘油或甲醇溶解研磨,使染料在乳缸內(nèi)顯得一面鏡光澤而無染料粉粒沉著后,再加入大量甲醇研磨,使其一面鏡光亮。靜置一會兒,將上層液體倒入清潔儲存瓶中(用甲醇空瓶),然后用甲醇研磨,重復幾次,直到乳缽中的染料和甲醇用完。染料完全轉移到儲存瓶后,搖勻,密封瓶口,室溫避光,儲存時間越長,染料溶解,分解越好,一般儲存3個月以上為好。
緩沖液
1)緩沖液的作用:染色對氫離子濃度非常敏感。根據(jù)觀察pH值的變化,蛋白質(zhì)和染料形成的化合物可以再次離解。緩沖液必須保持一定的pH以穩(wěn)定染色。PBS的pH一般為6.4~6.8。偏堿性染料可以中和緩沖液中的酸基,而偏酸性染料中和緩沖液中的堿基可以穩(wěn)定pH。
二、緩沖液配制(pH6.4~6.8,弱酸性):
配方1:配方2:
1%KH2PO430mlM/15KH2PO473.5ml
1%Na2HPO420mlM/15Na2HPO426.5ml。
H2O(新鮮)加到1000ml。
在室溫黑暗的地方,密封瓶口,防止霉菌污染,如有污染應報廢。